第359章
出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息。
DNA分子标记可分为哪几类？
（1）基于DNA-DNA（分子）杂交的分子标记
（2）基于PCR技术的分子标记
（3）基于PCR和限制性酶切相结合的分子标记
（4）基于DNA芯片杂交技术的分子标记
（5）针对特定结构域的分子标记
（6）高通量分子标记
3、试述限制性长度多态性（RFLP）标记产生的原理、特点和发展RFLP标记的基本步骤。
原理：（1）利用特定的限制性内切核酸酶消化不同生物个体的基因组DNA，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况
（2）琼脂糖凝胶电泳将这些片段按大顺序分离开来，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜和硝酸纤维膜。
（3）用放射性核素（如32P）或非放射性物质（如生物素、地高辛等）标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交
（4）经放射自显影或酶学检测，可显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性情况
特点：基本特点：（1）所检测到的等位基因具有共显性特点
（2）RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1～4个
（3）RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆（RG克隆）和PCR克隆
RFLP的优点：（1）共显性标记，可鉴别杂合、纯合基因型
不需要检测对象的序列信息
不足：（1）RFLP分析的探针，必须是单拷贝或寡拷贝的，否则不能显示清晰可辨的带型
（2）检测所需样本DNA量大（5～15μg）
（3）实验操作比较繁琐，检测少数几个探针时成本较高
（4）检测中如要利用放射性核素（通常为32P），易造成环境污染，检测周期长
（5）用非放射性标记系统（如Biotin系统、Dig系统及ECL系统）杂交信号相对较弱，灵敏度较低，相对价格较高
基本步骤：（1）DNA的提取
（2）限制性内切核酸酶酶切DNA
（3）凝胶电泳分开DNA片段
（4）把DNA片段转移到滤膜上
（5）利用放射性（或化学荧光等非放射性）标记的探针
（6）Southern杂交
（7）放射自显影显示特定的DNA片段
（8）分析结果
4、随机扩增多态性（RAPD）产生的原理是什么？与普通PCR标记反应相比，产生反应体系有什么特点？
原理：用任意寡聚脱氧核苷酸单链的片段（通常长度为8～10bp）作为引物（也称随机引物，通过PCR扩增染色体组中的DNA以获得长度不同的DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段，经染色来显示扩增片段的多态性（长度差别）。
扩增片段多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性
特点：（1）引物：单个，长度8～10bp
（2）反应条件：经典的PCR复性温度较高，一般为℃，而RAPD的复性温度仅为36℃左右
（3）扩增产物：RAPD产物为随机扩增。由于采用较短的随机单引物和低退火温度，一方面保证了核苷酸引物与模板的稳定配对，另一方面又允许适当的错配，从而扩大引物在基因组DNA中配对的范围，提高了基因组DNA分析的效率
5、何为扩增片段长度多态性（反应中产生的选择性限制片段扩增的原理是什么？
AFLP标记：是一种将限制性内切核酸酶酶切技术结合，产生不同长度片段来检测DNA多态性的分子标记技术
原理：
AFLP分析中为什么要进行连续2次PCR扩增？
通过两步扩增反应使产生的扩增结果更清楚、重复性更好
SSR标记的基本原理及建立SSR标记的一般程序。
基本原理：由于基因组中某一特定微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼两端互补序列人工合成引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR扩增处不同长度的产物，将扩增产物进行电泳，不同个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这又被称为简单序列重复长度多态性（SSLP）
程序：（1）建立基因组DNA文库
根据得到的SSR类型设计并合成寡聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组克隆
对阳性克隆DNA插入序列测序
根据SSR两侧序列设计并合成引物
以待研究的植物DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增反应
高浓度琼脂糖凝胶、非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性
如何将一个分析产生的片段转化成SCAR（序列特异扩增区域）标记？
（1）对基因组分析后，将目标RAPD片段进行克隆并对其末端测序
（2）根据RAPD片段两端序列设计特定引物（），一般引物前10个碱基应包括原来的RAPD扩增所用的引物
（3）以合成引物对基因组特异扩增
9、酶切扩增多态性序列（CAPS）是如何产生的？进行CAPS分析的基本程序是什么？
将PCR-扩增的DNA片段用限制性内切核酸酶切割，凝胶电泳分离酶切片段，从而得到限制
性片段长度多态性
程序：（1）利用特定引物进行PCR扩增
（2）将PCR扩增产物用限制性内切核酸酶酶切
（3）琼脂糖凝胶电泳将酶切产物DNA片段分开
（4）溴化乙锭（EB）染色，观察片段长度多态性
10、何为单核苷酸多态性（的来源有哪些？与其他分子标记相比，SNP有何特点？
概念：指不同个体基因组DNA序列之间单个核苷酸的变异。它又被称为第三代新型多态性标记
SNP的来源：单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入缺失
特点：（1）双等位型标记:单碱基替换包括：1个转换：）和）、（TA）（括号中是互补链，斜杠的左右表示同源染色体）
（2）在DNA分子分布不均匀：多在CpG甲基化位点发生CT转换
（3）密度高，多态性极其丰富。在人类基因组中，每1.3kb就有一个SNP。
（4）具有遗传稳定性基于单核苷酸的突变，突变率为多态性相比，具有更高的遗传稳定性
（5）SNPs的检测和分析易实现自动化。如应用DNA芯片技术，可实现大规模、自动化分析检测
11、简述构建遗传图谱的依据。
同源染色体减数分裂过程中会发生交换，交换的结果便使染色体上的基因发生重组，两个基因之间发生重组的频率取决于它们之间的相对距离。因此，只要准确地估计出交换值，进而确定基因在染色体上的相对位置就可绘制连锁遗传图
分子遗传图谱构建的包括哪些主要环节？
（1）选择适合绘图的分子标记，根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合
（2）建立作图群体，即具有大量分子标记处于分离状态的分离群体或衍生系
（3）群体中不同植株或品系的标记基因型的分析
（4）利用计算机程序建立标记之间的连锁关系
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